In 1590 kreeg Leiden zijn eerste botanische tuin, waar de bekende plantkundige Carolus Clusius fungeerde als boegbeeld. In dezelfde periode besloot het bestuur van Universiteit Leiden om de universiteitsbibliotheek te vestigen in een kleine kapel aan het Rapenburg. Dit werd meteen de locatie voor een zeer moderne faciliteit, namelijk het anatomisch theater.
Petrus Pauw, hoogleraar in Leiden en bedenker van het anatomische theater, had van 1581 tot 1584 in Leiden gestudeerd en zette zijn studie voort in Parijs, Rostock en Padua - de drie universiteiten waar anatomielessen werden gegeven. De hoogleraar was goed op de hoogte van de laatste ontwikkelingen op anatomisch gebied toen hij de kans kreeg om zijn faciliteit voor de Universiteit Leiden te bouwen. In het koor van de kapel werd, volgens Pauws wensen en ontwerp, een ronde houten constructie gebouwd die geïnspireerd was op de Romeinse arena's zoals het Colosseum, met trapsgewijs oplopende tribunes waar het publiek kon plaatsnemen. Drie keer per jaar vond er een ontleedkundige demonstratie plaats op een menselijk lichaam in het anatomisch theater. Geneeskundestudenten, studenten van andere faculteiten, leden van het chirurgijnsgilde en hun leerlingen en nieuwsgierige burgers woonden deze demonstraties bij.
De anatomische lessen vonden elke winter plaats, aangezien de lage temperaturen het bederf van de kadavers vertraagden. Zelfs als er geen lessen waren, kwam het publiek bijeen in het theater. Als er geen anatomielessen plaatsvonden, werden skeletten van mensen of dieren uit Brazilië en Egypte tentoongesteld op de balustrades van het theater en in vitrinekastjes aan de muur.
